Neuron︱小胶质细胞C9orf72基因缺失促进突触丢失, 学习记忆缺陷的新机制
撰文︱Sucre
责编︱王思珍
C9orf72基因，全称chromosome 9 open reading frame 72。C9orf72的非编码六核苷酸重复序列（GGGGCC）扩增是导致肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）的最为常见的遗传因素，引起神经元的损伤和死亡【1-2】。ALS和FTD的主要特征分别为运动皮层和脊髓的运动神经元退行，额叶和前颞叶的皮质神经元退行。
C9orf72重复序列扩增可以被转录为不同种类的RNA，并翻译产生二肽重复（DPR）蛋白；DPR蛋白在神经元中积累，引起功能获得性毒性（gain-of-function toxicity）【3】。然而，重复序列扩增也会降低C9orf72的RNA和蛋白的水平，影响其正常功能的发挥，提示该基因的单倍剂量不足与FTD的发病机制相关【4-5】。而且，在ALS/FTD中，C9orf72的缺失会加剧自噬和溶酶体运输缺陷，并协同DPR蛋白的积累和毒性，影响细胞的清除功能，导致细胞死亡，进一步暗示了C9orf72的综合致病机制【6-7】。 此外，除了FTD/ALS，也有报道称，C9orf72重复序列扩增与其他的神经退行性疾病的发生发展密切相关，比如阿尔茨海默症（AD）【8】。
C9orf72在大脑中所有类型的细胞中都有表达，但在小胶质细胞中的表达最高【9】。然而，C9orf72在小胶质细胞中的功能、以及其在神经退行性疾病发生发展过程中扮演的角色，尚不清楚。
近日，来自美国华盛顿大学圣路易斯分校的Robert H. Baloh团队与西达赛奈医疗中心的Rita Sattler团队合作在Neuron上发表了题为C9orf72 deficiency promotes microglial-mediated synaptic loss in aging and amyloid accumulation的最新研究论文。在该研究中，作者结合遗传学、转录组分析、免疫组织化学以及行为学等研究手段，发现，特异性敲除小胶质细胞中C9orf72基因能够显著改变衰老动物和AD小鼠中的小胶质细胞的转录谱和生理功能，通过增强突触的修剪功和引起神经元的损伤，从而导致AD小鼠的学习记忆功能障碍。
文章中，为了研究C9orf72基因缺陷对小胶质细胞功能的影响，作者对不同月龄（3和17月龄）、不同基因型（C9orf72+/+，C9orf72+/-和 C9orf72-/-）的小鼠小胶质细胞进行了转录组学分析（Bulk RNA测序、单细胞RNA测序），结果显示，C9orf72-/-小鼠表现出与年龄相关的激活性小胶质细胞应答（ARM）特征基因表达水平的降低，以及干扰素小胶质细胞应答（IRM）特征基因表达水平的升高，且这些IRM基因很有可能是因为干扰素基因刺激因子（STING）活性增强所导致。换言之，C9orf72基因缺陷的小胶质细胞转录水平发生改变，同时炎症状态也增强（图1）。
图1 C9orf72-/-小鼠小胶质细胞转录组的改变
（图片引自：Renton AE, et al., Neuron 2021）
图2 C9orf72-/-小鼠的突触和行为缺陷
（图片引自：Renton AE, et al., Neuron 2021）
此前有报道称，在正常发育过程和疾病过程中，小胶质细胞都发挥了调节补体介导的突触消除功能【10-11】。由于小胶质细胞是中枢神经系统中补体C1q的主要来源，并且在衰老以及神经退行性疾病中，往往伴随着C1q表达水平的上升【12】。因此，作者通过免疫组化和蛋白质印记的方法，发现，与野生型（WT）小鼠相比，C9orf72-/-小鼠运动皮层中C1q水平显著升高，突触标志物（比如突触素（synaptophysin）、vGLUT1和PSD95）水平显著下降，以及树突的分枝和突起的长度显著减少，即突触出现丢失。值得一提的是，相比于WT小鼠，杂合小鼠的补体蛋白C1q水平和突触标记蛋白水平都没有显著性差异。作者也发现，突触的标记蛋白vGLUT1和PSD95在小胶质细胞中的聚集也显著增强，即小胶质细胞通过异吞噬异常突触，以发挥突触的修剪功能。另外，巴恩斯迷宫（Barnes maze）行为学测试发现，老年C9orf72-/-小鼠的空间学习和记忆能力相比同月龄的C9orf72+/+，C9orf72+/-小鼠显著变差。此外，与之前报道类似，作者也发现，衰老的C9orf72-/-小鼠小胶质细胞中CD68溶酶体堆积增强（CD68标记溶酶体）。这些表明：C9orf72缺失的小胶质细胞能够引起老年小鼠神经元树突的形态异常和补体介导的突触丧失，从而导致认知缺陷（图2）。
图3 C9orf72-/-小胶质细胞增强突触修剪和吞噬作用
（图片引自：Renton AE, et al., Neuron 2021）
有研究暗示，C9orf72蛋白在神经元中表现出细胞自主表型。在此，为了进一步研究C9orf72蛋白在不同细胞类型中的细胞自主和非细胞自主作用，作者首先进行体外神经元-小胶质细胞共培养实验，发现C9orf72蛋白的缺失不会导致皮质神经元突触蛋白水平的任何显著变化，但会增强C9orf72-/-小胶质细胞的吞噬活性；接着，作者构建了小胶质细胞C9orf72基因的特异性敲除小鼠，以在体内研究小胶质细胞中C9orf72蛋白缺失的细胞自主效应，结果发现，CD68阳性的溶酶体聚集物在小胶质细胞中显著上升，突触蛋白水平明显下降，补体蛋白C1q水平也有所升高，这一结果与完全敲除C9orf72结果相一致。这些结果说明：小胶质细胞中C9orf72基因的缺失会自主性地驱动（激活）小胶细胞的吞噬活性（功能），并诱导神经元突触的缺失（图3, 4）。
图4 小胶质细胞特异性C9orf72-/-敲除小鼠表现出突触修剪的增强
（图片引自：Renton AE, et al., Neuron 2021）
图5 降低C9orf72基因的表达可减少淀粉样斑块
（图片引自：Renton AE, et al., Neuron 2021）
C9orf72重复序列扩增也与其他神经退行性疾病综有关，包括AD、亨廷顿氏病、皮质基底综合征、橄榄脑桥小脑变性、帕金森病和精神疾病等【8, 13, 14】。小胶质细胞在AD病理过程中发挥着重要作用，小胶质细胞基因表达可影响AD的风险（发生）【15】。因此，作者构建了5XFAD/C9orf72-/-杂交小鼠，并发现，杂交小鼠皮层、海马等大脑区域的β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块减少了，不可溶性Aβ42/Aβ40比值也降低了，杂交小鼠小胶质细胞对Aβ斑块吞噬能力也增强了。也就是说，小胶质细胞中C9orf72缺失可以增强细胞对Aβ斑块的清除，但是，同时，作者也发现，杂交小鼠，即小胶质细胞C9orf72缺失的AD小鼠，小胶质溶酶体积累增多，突触丢失加剧、神经损伤恶化、空间学习和记忆障碍也加剧（图5, 6）。
图6 5XFAD/C9orf72-/-杂交小鼠小胶质溶酶体积累增强和神经元和突触缺陷加剧
（图片引自：Renton AE, et al., Neuron 2021）
文章结论与
图7 文章总结图：C9orf72基因缺陷促进小胶质细胞介导的突触缺失和认知能力下降
（图片引自：Renton AE, et al., Neuron 2021）
中枢神经系统中的细胞类型复杂且多样，未来的研究中，可以考虑特异性敲除其他类型细胞中的C9orf72基因（比如星形胶质细胞，神经元，少突胶质细胞），或者同时敲除神经元与小胶质细胞中的C9orf72基因，以研究该基因敲除后对突触功能和神经退行性疾病发生发展的影响。
另外，敲除C9orf72，一方面会激活胶质细胞的功能进而引起突触的功能障碍，另一方面也会减轻淀粉样蛋白的聚集，那么如何避免前者而充分发挥后者的作用，可能是一种治疗神经退行性疾病的潜在方法。同时，小胶质细胞C9orf72基因敲除，对其他如帕金森氏症等神经退行性疾病的发生发展又有何影响，可能也是值得研究的问题。
总的来说，这项研究表明：小胶质细胞中C9orf72的缺失会导致其转录谱的改变，扰素小胶质细胞应答特征基因表达水平的升高，进而地，激活的小胶质细胞参与增强突触修剪（突触清除），导致ALS/FTD和AD小鼠模型的神经功能障碍和随后的学习和记忆缺陷（图7）。
原文连接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2021.05.020
参考文献（上下滑动查看）
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制版︱王思珍
本文完